|
|
In silico design and validation of conotoxin-based peptides for neuroblastoma nanotherapy
Mokrý, Michal ; Gumulec, Jaromír (oponent) ; Heger, Zbyněk (vedoucí práce)
This thesis is focused on in silico design and validation of peptides based on -MrIA conotoxin from Conus marmoreus marine snail species, and their possible use in the treatment of neuroblastoma through norepinephrine transporter targeting. Five conotoxin-based peptides were designed using molecular dynamics simulations, and their trajectories were analyzed to determine peptide properties. Two homology models of human norepinephrine transporter were prepared for further analysis of binding properties of the conotoxin-based peptides to norepinephrine transporter. Peptides were synthesized and used to coat apoferritin nanoparticles with cytotoxic agent ellipticine trapped inside apoferritin’s cavity. Created peptides and nanoparticles were analyzed to determine their physico-chemical characteristics. Furthermore, cellular uptake and cytotoxicity towards neuroblastoma and epithelial cell lines were studied. From both in silico and in vitro studies, it appears that YKL-6 peptide is the best candidate for further research.
|
|
|
Study the optimal condition to knockout metallothionein by CRISPR-Cas9 in neuroblastoma
Májková, Klára
Při léčbě neuroblastomu (Nbl), embryonálního nádoru, který nejčastěji postihuje kojence a děti mladší pěti let, se často používají léčebné strategie založené na cisplatině. Bylo však zjištěno, že účinnost těchto strategií je nižší než 50 % v důsledku chemorezistence nádorových buněk. Tato rezistence byla spojena se zvýšenou expresí metalothioneinů (MTs) v buňkách neuroblastomu. Lidský metalothionein 3 (hMT-3), protein exprimovaný především v buňkách centrální nervové soustavy, hraje zásadní roli v detoxikaci kovů a udržování homeostázy během oxidačního stresu. Knock out metalothioneinu 3 pomocí CRISPR/Cas9 by proto mohl buňky opět učinit citlivými na cytotoxická léčiva. Cílem této studie bylo optimalizovat podmínky pro úspěšné vyřazení MT3 z neuroblastomu. Plazmid MT3-CRISPR/Cas9 byl transfekován do neuroblastomu pomocí přípravku Lipofectamine 2000 ve třech různých koncentracích (250 ng/µl, 500 ng/µl a 1000 ng/µl). Optimálních podmínek bylo dosaženo při použití 0,75 µl přípravku Lipofectamine, 1000 ng/µl plazmidu a 0,5 ng/µl puromycinu.
|
|
|
Rozdíly v acetylaci histonů v normoxii a hypoxii
Čepek, Pavel ; Poljaková, Jitka (vedoucí práce) ; Eckschlager, Tomáš (oponent)
Histony a jejich N a C konce podléhají kovalentním modifikacím, které regulují transkripci genů. Mezi histonové modifikace patří methylace, ubikvitinylace, SUMOylace, ADP- ribosylace, fosforylace, prolinová izomerace, deiminace a acetylace. Acetylace histonů je regulována histonacetyltransferasami (HATs) a histondeacetylasami (HDACs). Rovnováha mezi acetylací/deacetylací histonů ovlivňuje kompaktnost chromatinu a podílí se na regulaci genové exprese. U řady lidských nádorů je acetylační rovnováha porušena a může přispívat k rozvoji maligních onemocnění. Inhibitory histondeacetylas (HDACi) umožňují tuto porušenou acetylační rovnováhu vyrovnávat. Jeden z těchto inhibitorů je kyselina valproová (VPA), již používaná k léčbě epilepsie. V několika studiích bylo prokázáno, že VPA vykazuje protinádorové účinky. U nádorových neuroblastomových linií byla zaznamenána např. snížená exprese n-myc onkoproteinu, inhibice buněčného růstu či angiogeneze. Ačkoliv je přesný mechanizmus účinku VPA na nádorové buněčné linie stále nejasný, za jeden z důležitých protinádorových účinků je povážována hyperacetylace histonů H3 a H4. V této práci je ukázáno, že kyselina valproová zvyšuje acetylaci histonů H3 a H4 v lidských neuroblastomových buněčných liniích UKF-NB-3 a SK-N-AS. Nejvyšší acetylace histonu H3 byla v hypoxii...
|
|
|
Epigeneticky podmíněná chemorezistence nádorových buněk
Feriančiková, Barbara ; Eckschlager, Tomáš (vedoucí práce) ; Šácha, Pavel (oponent)
Nádorová onemocnění jsou i přes významné pokroky v diagnostice a léčbě druhou nejčastější příčinou úmrtí v ekonomicky vyspělých státech. Hlavním důvodem selhání proti- nádorové terapie je rozvoj chemorezistence, která může být buď vnitřní, nebo získaná, a je primárně zprostředkovaná aktivací různých klíčových regulátorů (např. MDR, PI3K/Akt apod.). Na aktivaci těchto drah se podílejí genetické a epigenetické mechanismy. Mezi vý- znamné epigenetické mechanismy, které se mohou účastnit na vzniku chemorezistence, patří regulace genové exprese prostřednictvím mikroRNA (miRNA) a dlouhých nekódujících RNA (lncRNA). Deregulovaná exprese těchto nekódujících RNA byla pozorována v mnoha one- mocněních a byl prokázán jejich podíl na vzniku a progresi zhoubných nádorů. V práci jsme sledovali expresi dlouhé nekódující RNA MIAT v hypoxii (1% O2) u chemosenzitivních a chemorezistentních buněčných linií neuroblastomu (NBL), neboť hy- poxie je významným negativním prognostickým faktorem řady nádorů a podílí se právě na chemorezistenci. Relativní exprese MIAT byla ovlivněna počtem kultivovaných buněk, kdy se zvyšovala její exprese s kultivací většího počtu buněk. Exprese MIAT byla také signi- fikantně zvýšena již po 6 h kultivace NBL linie UKF-NB-4 v hypoxických podmínkách a maxima dosahovala po 48 h s následným...
|
|
|
Srovnání vlastností buněčných linií rezistentních k ellipticinu, doxorubicinu a cisplatině
Černá, Tereza ; Poljaková, Jitka (vedoucí práce) ; Eckschlager, Tomáš (oponent)
6 Abstrakt Neuroblastom je nejčastější solidní extrakraniální nádor dětského věku. I přes veškeré pokroky v onkologické diagnostice a terapii je léčba některých forem neuroblastomu stále obtížná. Jednou z největších komplikací chemoterapie je vznik lékové rezistence. Tato práce se zabývá vlivem cytostatik na expresi vybraných proteinů, které se mohou podílet na chemorezistenci lidské neuroblastomové buněčné linie UKF-NB-4 na proteinové úrovni i na úrovni genové exprese. Senzitivní linie UKF-NB-4 a od ní odvozené rezistentní linie UKF-NB-4CDDP , UKF-NB-4DOXO a UKF-NB-4ELLI byly vystaveny působení cisplatiny, doxorubicinu nebo ellipticinu po dobu 24, 48 a 72 hodin. Metodou Western blot bylo prokázáno, že cytostatika cisplatina, doxorubicin nebo ellipticin podaná senzitivní neuroblastomové buněčné linii UKF-NB-4 v množstvích, která jsou přidávána do kultivačního média rezistentních neuroblastomových linií pro udržování rezistence, indukují po 72 hodinové kultivaci v této buněčné linii expresi proteinu p53 a zároveň snižují množství retinoblastomového proteinu pRb. Rozdíly v expresi proteinu RAS, cytochromů P450 1A1, 3A4 a cytochromu b5 nebyly prokázány. Změny v expresi studovaných proteinů u rezistentních linií UKF-NB-4CDDP , UKF-NB-4DOXO a UKF-NB-4ELLI kultivovaných s a bez přídavku daného cytostatika nejsou...
|
|
|
Účinky přírodních látek na viabilitu nádorových buněčných linií
Boleslavská, Barbora ; Poljaková, Jitka (vedoucí práce) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Nádorová onemocnění jsou jedním z nejzávažnějších problémů současné medicíny a jejich incidence neustále stoupá. Navzdory výraznému rozvoji terapeutických metod v posledních letech jsou tato onemocnění stále velmi obtížně léčitelná. Předkládaná práce se zabývá sledováním účinků přírodních látek - epigalokatechin galátu, kofeinu, etanolového extraktu z Cannabis sativa, vodného extraktu z Origanum acutidens a vodného extraktu z Mentha piperita na lidskou neuroblastomovou buněčnou linii UKF-NB-4. První část práce se zabývá určením viability lidské neuroblastomové buněčné linie UKF-NB-4 vystavené působení testovaných látek. Dále je studován vliv těchto látek na buněčný cyklus, aktivitu kaspáz a schopnost vyvolat apoptosu. Detekce výše zmíněných charakteristik byla prováděna na buněčném analyzátoru MUSETM a na průtokovém cytometru. Následně byla pomocí metody Western blot sledována hladina proteinu p53 a retinoblastomového proteinu v buněčné linii UKF-NB-4 vystavené působení testovaných látek. Největší vliv měl na viabilitu a buněčný cyklus lidské neuroblastomové buněčné linie epigalokatechin galát. Jeho působením dochází ke snížení viability UKF-NB-4, ke snížení exprese retinoblastomového proteinu a k zadržení přechodu buněk z G0/G1 do S fáze buněčného cyklu. Z výsledků nevyplývá, že by epigalokatechin...
|
|
|
Epigenetické a cytotoxické účinky inhibitorů histondeacetyláz v kombinaci s cytostatiky na buňky neuroblastomu
Abdel Rahman, Mohamed Ashraf Khalil ; Eckschlager, Tomáš (vedoucí práce) ; Mandys, Václav (oponent) ; Krsková, Lenka (oponent)
Souhrn Zvýšená exprese histondeacetyláz (HDAC) u řady nádorů obrátila pozornost k možnosti využít jejich inhibici k protinádorové léčbě. Kyselina valproová (VPA) je nejen užívané antiepileptikum, ale vykazuje i protinádorové účinky podmíněné inhibicí HDAC třídy I a IIa. Předpokládá se, že nádorové kmenové buňky (CSC) jsou odpovědné za růst a progresi nádorů a proto je snaha zacílit léčbu na malou subpopulaci CSC spíše než na celý nádor. CD133 byl rozpoznán jako marker CSC u řady nádorů. Jeho exprese je významně ovlivněna epigenetickými změnami, mezi něž patří podání inhibitorů HDAC užívaných v léčbě nádorů. Proto jsme se zabývali epigenetickými a cytotoxickými účinky VPA v kombinaci s některými chemoterapeutiky a jejím vlivem na expresi antigenu CD133 u lidských neuroblastomových (NB) buněčných linií. Naše výsledky ukázaly, že kombinace VPA s DNA poškozujícími cytostatiky má u buněk UKF-NB-4 synergistický účinek podmíněný indukcí apoptózy závislé na aktivaci caspázy-3. Tento synergizmus byl ve vztahu ke zvýšení acetylace histonů H3 a H4 a byl přítomen pouze při současné inkubaci s oběmi látkami nebo při inkubaci s DNA poškozujícím cytostatikem následované inkubací s VPA. Výsledky další studie ukazují, že VPA indukuje expresi CD133, která je závislá na zvýšení acetylace histonů H3 a H4. Při inkubaci s VPA a...
|
|
|
Působení inhibitorů V-ATPasy na chemorezistentní linie neuroblastomu in vitro
Honzejková, Karolína ; Eckschlager, Tomáš (vedoucí práce) ; Martínková, Markéta (oponent)
Nádorová onemocnění se řadí mezi nejčastější příčiny úmrtí na celém světě a přes velký pokrok v léčebných postupech v posledních padesáti letech se stále jedná o závažný zdravotní problém. Proto je stále soustředěno velké úsilí na vývoj nových protinádorových léků a terapeutických přístupů. Neuroblastom (NBL) je nejčastější nádorové onemocnění u kojenců a čtvrté nejčastější u dětí. Úspěšnou léčbu značně komplikuje jeho heterogenita. Při chemoterapii je nežádoucím jevem léková rezistence. Jedním z mechanismů chemorezistence je akumulace slabě bazických protinádorových léčiv v lysosomech. Tato práce se zabývá měřením lysosomálního "uptaku" těchto látek v neuroblastomových buněčných liniích UKF-NB-4 a této linii rezistentní vůči ellipticinu (UKF-NB-4ELLI ) za různých podmínek. Byla zavedena metoda stanovení kapacity (objemu) buněčných lysosomů pomocí měření intenzity fluorescence barviva specifického pro lysosomy, LysoTracker Red (LTR), a dále byla zkoumána schopnost bafilomycinu A, inhibitoru vakuolární ATPasy (V-ATPasy), potencovat účinky ellipticinu inhibicí jeho lysosomální akumulace. Klíčová slova: neuroblastom, lysosom, vakuolární ATPasa, víceléková rezistence
|
|
|
Exprese inhibičního faktoru migrace makrofágů u neuroblastomových buněčných linií
Polatová, Daniela ; Poljaková, Jitka (vedoucí práce) ; Groh, Tomáš (oponent)
Inhibiční faktor migrace makrofágů (MIF) je cytokin, který se přímo účastní imunitních reakcí organismu vyvolaných vnějším podnětem, např. lipopolysacharidy bakterií nebo glukokortikoidy. Na základě stimulace těmito látkami je MIF uvolňován z makrofágů. Sám aktivuje další makrofágy a T-lymfocyty a umožňuje tak uvolnění protizánětlivých cytokinů. Podílí se též na angiogenezi, neboť endogenně produkovaný MIF je naprosto nezbytný pro proliferaci endoteliálních buněk. K tvorbě nových cév stimulované MIF dochází i u nádorů, což vede k jejich růstu. Přirozeným receptorem pro MIF je integrální membránový protein CD74, který může být vystaven na povrchu buněk. Pokud je vystaven na povrchu T-lymfocytů, může být modifikován chondroitin- sulfátem a interagovat s proteinem CD44, což je důležité k efektivní aktivaci T-buněk. Na komplex CD74-CD44 se poté váže MIF. V rámci této bakalářské práce byla studována přítomnost CD74 v lidských neuroblastomových buněčných liniích UKF-NB-3 a UKF-NB-4. Elektroforézou a následnou metodou ,,Western blot" byla detekována přítomnost CD74 v linii UKF-NB-4, v linii UKF-NB-3 CD74 detekován nebyl. Přítomnost CD74 v neuroblastomových buněčných liniích indikuje, že i neuroblastomy mohou být ovlivňovány MIF. Klíčová slova: MIF, CD74, neuroblastom, tkáňové kultivace, Western blot
|
|
|
In silico design and validation of conotoxin-based peptides for neuroblastoma nanotherapy
Mokrý, Michal ; Gumulec, Jaromír (oponent) ; Heger, Zbyněk (vedoucí práce)
This thesis is focused on in silico design and validation of peptides based on -MrIA conotoxin from Conus marmoreus marine snail species, and their possible use in the treatment of neuroblastoma through norepinephrine transporter targeting. Five conotoxin-based peptides were designed using molecular dynamics simulations, and their trajectories were analyzed to determine peptide properties. Two homology models of human norepinephrine transporter were prepared for further analysis of binding properties of the conotoxin-based peptides to norepinephrine transporter. Peptides were synthesized and used to coat apoferritin nanoparticles with cytotoxic agent ellipticine trapped inside apoferritin’s cavity. Created peptides and nanoparticles were analyzed to determine their physico-chemical characteristics. Furthermore, cellular uptake and cytotoxicity towards neuroblastoma and epithelial cell lines were studied. From both in silico and in vitro studies, it appears that YKL-6 peptide is the best candidate for further research.
|
host ::
RSS.